Spektrofotometri

PEMBAHASAN

Tujuan dan Prinsip Kerja Spektrofotometer

Spektrofotometer bekerja berdasarkan pada prinsip penyerapan gelombang cahaya (radiasi) yang dilewatkan pada suatu larutan. Spektrofotometer yang digunakan adalahvisible atau menggunakan cahaya tampak, yang panjang gelombang terukurnya berkisar antara 340 nm – 1000 nm. Panjang gelombang maksimum dicari untuk mengetahui seberapa besar energi cahaya tertinggi yang diserap oleh suatu larutan.

Jenis-jenis spektrofotometer terbagi menjadi Spektrofotometer UV- Visible, Spektrofotometer Infra merah, Spektrofotometer Serapan Atom (SSA), Spektrofotometer Resonansi Magnetik (NMR), Spektrofotometer Pendar Molecular (pendar fluor/pendar fosfor) dan Spektrofotometer dengan metode hamburan cahaya ( nefelometer, turbidimeter dan spektrofotometer Raman).

Metode spektrofotometer dapat digunakan dengan pengukuran kuntitatif, yaitu besarnya energy yang diserap oleh larutan sebanding dengan konsentrasi dan tebal larutan. Hubungan ini dapat dituliskan pada persamaan berdasarkan pada hukum Lambert-Beer:

A= ab c

dengan A merupakan absorbansi, a adalah koefisien absorpsi (absorpsivitas), b ialah ketebalan sampel dan c adalah konsentrasi molekul sampel (larutan) (Depdikbud Pusat Penelitian UNAND 1988).

Metode spektrofotometri visibel merupakan metode modern yang lebih mengarah pada penggunaan alat atau instrumen yang canggih. Prinsip spektrofotometri didasarkan adanya interaksi dari energi radiasi elektromagnetik dengan zat kimia (Sudarmadji dkk., 1996). Apabila senyawa fisik tidak berwarna maka senyawa diubah dulu menjadi senyawa berwarna melalui reaksi kimia dan absorbansi ditentukan dalam daerah sinar tampak (Roth dan Blaschke, 1998).

Pada metode spektrofotometri visibel ini dengan memanfaatkan sifat dari besi (III) yang spesifik jika direaksikan dengan asam salisilat akan membentuk kompleks warna ungu. Untuk memperoleh ion besi (III) maka besi (II) sulfat harus dioksidasi terlebih dahulu. Oksidator yang digunakan untuk mengoksidasi besi (II) menjadi besi (III) yaitu kalium permanganat. Kalium permanganat ini akan mengoksidasi sempurna dalam suasana asam kemudian besi (III) yang terbentuk direaksikan dengan asam salisilat akan membentuk kompleks warna ungu.

Spektrofotometri merupakan metode yang baru sehingga perlu dilakukan validasi metode yang meliputi akurasi, ripitabilitas dan linieritas. Dalam Farmakope Indonesia menyebutkan bahwa suatu metode baru hanya dapat digunakan apabila metode tersebut sekurang – kurangnya memberikan ketepatan, ketelitian, dan selektifitas yang sama dengan metode resmi dalam Farmakope Indonesia.

Pengukuran kuantitatif

Apabila anda mempunyai larutan dengan deret warna yang semakin pekat. Kemudian anda mengukur absorbasinya (jumlah cahaya yang diserap). Maka akan didapatkan suatu kurva linier. Jumlah cahaya yang diserap semakin banyak seiring dengan intensitas warna yang semakin pekat. Deret warna ini dalam dunia analisis kimia di sebut sebagai deret standar. Dan jika suatu larutan telah diketahui absorbansinya, maka konsentrasinya-pun dapat diketahui dengan membandingkan terhadap deret standar. Inilah prinsip dasar pengukuran konsentrasi menggunakan spektro-vis.

Limitasi dalam Spketro-Vis

Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah pada konsentrasi yang terlalu pekat, kurva deret standar menjadi tidak linier. Biasanya konsentrasi di atas 0.1 M. Hal ini karena pada konsentrasi yang tinggi, jarak antar partikel zat menjadi sangat rapat. Hal ini akan mempengaruhi distribusi muatan, dan mengubah cara molekul melakukan serapan. Oleh karena itu terkadang pada konsentrasi terlalu tinggi kurva tidak linier. Itulah sebabnya pada pembuatan deret standar, absorbansi dianjurkan tidak melebih 1. Jadi absorbansi deret standar ada di dalam range 0-1. Perbedaan kuvet sangat berpengaruh. Harap selalu gunakan satu kuvet yang sama untuk mengukur absorbansi. Apabila anda terlibat dengan sample yang jumlahnya banyak, dan anda menggunakan kuvet disposable, gunakan kuvet maksimal tiga kali pemakaian. Setelah itu pakai kuvet baru. Terkadang senyawa analat mengalami reaksi kimia yang lambat dan memerlukan waktu untuk mencapai kesetimbangan. Hal ini menyebabkan penyimpangan yang signifikan bila pembacaan absorbansi tidak dilakukan bersamaan. Lakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang maksimal. Jangan sungkan untuk mencari terlebih dulu pada panjang gelombang berapa sample memberikan absorbansi maksimal. Hal ini untuk meningkatkan sensitifitas analisa

Bromothymol biru (juga dikenal sebagai phthalein sulfon bromothymol, Bromthymol Blue, dan BTB) adalah bahan kimia indikator untuk lemah asam dan basa . kimia ini juga digunakan untuk mengamati fotosintesis kegiatan atau indikator pernapasan (berubah kuning seperti CO ₂ ditambahkan).

Bromothymol biru (juga dikenal sebagai phthalein sulfon bromothymol, Bromthymol Blue, dan BTB) adalah bahan kimia indikator untuk lemah asam dan basa . kimia ini juga digunakan untuk mengamati fotosintesis kegiatan atau indikator pernapasan (berubah kuning seperti CO ₂ ditambahkan).

Bromothymol biru bertindak sebagai asam lemah dalam larutan. Dengan demikian dapat berupa terprotonasi atau terdeprotonasi, muncul kuning dan biru masing-masing. Hal ini hijau kebiruan dalam larutan netral. Hal ini biasanya dijual dalam bentuk padat sebagai natrium garam indikator asam. Hal ini juga menemukan penggunaan sesekali di laboratorium sebagai slide biologis noda . Pada titik ini sudah biru, dan menjatuhkan satu atau dua digunakan pada slide air. Kaca penutup ditempatkan di atas tetesan air dan spesimen di dalamnya, dengan warna biru campuran masuk Hal ini kadang-kadang digunakan untuk mendefinisikan dinding sel atau inti di bawah mikroskop.

Bromothymol biru banyak digunakan untuk mengukur zat yang akan memiliki tingkat asam atau dasar relatif rendah (dekat dengan pH netral). Hal ini sering digunakan dalam pengelolaan pH kolam dan tangki ikan, dan untuk mengukur keberadaan asam karbonat dalam cairan.

Sebuah demonstrasi sifat umum pH BTB's indikator melibatkan mengembuskan melalui tabung ke dalam larutan netral BTB. Seperti karbon dioksida diserap dari nafas ke dalam larutan, membentuk asam karbonat , solusi perubahan warna dari hijau ke kuning. Dengan demikian, BTB umumnya digunakan dalam kelas-kelas sains sekolah menengah untuk menunjukkan bahwa semakin bahwa otot yang digunakan, semakin besar CO ₂ output.

pKa untuk biru bromothymol adalah 7.10.

warna Indikator

BTB indikator dalam larutan asam, netral, dan basa (kiri ke kanan).

Bromothymol Blue ( pH indicator )
below pH 6.0 pH di bawah 6,0		above pH 7.6 di atas pH 7,6
6.0 6.0	↔ ↔	7.6 7.6

Netral Merah (atau merah toluylene, Dasar Merah 5, atau CI 50040) adalah eurhodin pewarna yang digunakan untuk pewarnaan dalam histologi . Hal ini digunakan sebagai noda umum di histologi , sebagai counterstain dalam kombinasi dengan pewarna lain, dan untuk metode pewarnaan banyak. Bersama dengan Janus Green B digunakan untuk noda embrional jaringan dan supravital pewarnaan darah . Dapat digunakan untuk pewarnaan aparatus Golgi dalam sel dan butiran Nissl di neuron . Netral merah dapat digunakan sebagai vital noda , untuk noda sel hidup. Hal ini digunakan untuk noda kultur sel untuk plat titrasi dari virus . Netral merah ditambahkan ke beberapa media pertumbuhan untuk bakteri dan kultur sel . Biasanya datang sebagai klorida garam. Neutral Red bertindak sebagai indikator pH , perubahan dari merah ke kuning antara pH 6,8-8,0.

Neutral red (pH indicator)
below pH 6.8		above pH 8.0
6.8	↔	8.0

Neutral red

Rumus Molekul : C15H16N4.HCL

Di laboratorium spektrofotometer meggunakan Neutral Red untuk mengukur absorbansi pewarna merah, merah netral. Kemudian Anda akan grafik hasil menggunakan Excel untuk menemukan panjang max) dan memperkirakanlgelombang dengan absorbansi maksimum (λmax) dari pewarna pada (e) absorptivitas .

Cara Pembacaan Absorbansi Dengan Spektrofotometer

Pembacaan absorbansi sampel

Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya terletak antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitan. Hal ini disebabkan karena kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal (Gandjar dan Rohman, 2007).

DAFTAR PUSTAKA

[Depdikbud] Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Pusat Penelitian Universitas Andalas. 1988. Kimia dan Lingkungan. Theresia Sita Kusuma, penyunting. Padang : Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Pusat Penelitian Universitas Andalas

Harjadi,W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia.

Day. R. A, Jr & Underwood. A. L. 1994. Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi ke-6. Soendoro R, W Widiningsih, Rhajeng Sri, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Quantaive Analysis, 6th Edition.

Anonim. 2010. Spektrofotometri. [terhubung berkala].
http://sciencefair.math.iit.edu/techniques/spectrophotometer/Spektrofotom
etri.jpg [27 Maret 2010]

Roth, J.H., dan Blaschke, G., (1998). Analisis Farmasi. Penerjemah: Kisman, dkk.

Yogyakarta: UGM Press: hal. 355-357

Sudarmadji, dkk. 1996. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Penerbit Liberty.